师：同学们，今天我们复习多聚酶链式反应扩增DNA片段和DNA粗提取与鉴定，这两项都属于研究DNA的分子生物学技术。单独看，DNA粗提取技术可能平淡，PCR技术只是重复扩增某DNA片段，但它们的成熟，让我们能解决生活中一系列复杂问题。现在就有个问题，需要利用这两项技术解决。

　　在畜牧生产中，控制哺乳动物性别意义重大。比如奶牛等以产奶为主的家畜，我们希望多生母畜；肉用家畜则希望多生公畜。怎样让哺乳动物按人的意愿生产所需性别的后代呢？可以对胚胎进行性别鉴定，选择囊胚期胚胎，用分割针取滋养层细胞，然后分析DNA。那怎样分析DNA进行性别鉴定呢？能不能通过观察性染色体组成来鉴定？大家看下面资料。

　　从资料可知，性别决定最终并非直接由性染色体决定。从分子水平说，SRY基因是决定性别的基因。所以，对DNA做性别鉴定，只需检测细胞提取的DNA中有无SRY基因，有则为雄性胚胎，无则为雌性胚胎。那怎样检测SRY基因呢？

　　我们可以利用DNA分子杂交技术。同学们结合图回忆下，DNA分子杂交技术的原理是什么？

　　生：碱基互补配对，也就是目的基因片段与基因探针之间进行碱基互补配对。针对胚胎性别鉴定，就是用特定基因探针与SRY基因片段进行碱基互补配对。

　　师：那怎么设计这个特定探针呢？

　　生：根据SRY基因的碱基排列顺序，通过碱基互补配对设计特定基因探针。基因探针就是一段带有检测标记、序列已知，能与目的基因进行碱基互补配对的核苷酸序列。

　　师：怎样分析分子杂交结果鉴定胚胎性别呢？

　　生：如果存在SRY基因，SRY基因片段就会与特定探针碱基互补配对，形成DNA双链结构，即出现杂交带。出现杂交带为阳性反应，胚胎为雄性；没出现杂交带为阴性反应，胚胎为雌性。

　　师：讲到这，看似胚胎性别鉴定问题解决了，其实不然。取滋养层细胞要保证胚胎活性，鉴定时又要保证DNA中有足够的SRY基因，怎么解决这个矛盾？

　　生：可以在体外利用PCR技术扩增SRY基因。PCR操作简单，把所需物质加到微型离心管，在PCR仪设定程序就行。

　　师：在微型离心管中，要加入哪些物质？

　　生：从胚胎细胞提取的DNA作为母本，四种脱氧核苷三磷酸作为原料，还有引物、Taq酶和缓冲溶液。

　　师：原料为什么是脱氧核糖三磷酸？

　　生：从它的结构式看，脱氧核糖磷酸水解后，既能为PCR过程提供原料，又能提供能量。而且这里不需加入解旋酶，通过高温使DNA双链打开。

　　师：在这个反应体系中，怎样特异性扩增SRY基因的DNA片段？

　　生：引物很重要。Taq酶只能特异性复制处于两个引物之间的DNA序列，结合SRY基因位置，引物c和引物d可排除。Taq酶只能从引物的3'端延伸DNA链，根据模板链方向确定引物方向，引物f和引物a也排除了，所以只能用b和e才能特异性扩增SRY基因的DNA片段。

　　师：怎样设计引物b和引物e的碱基排列顺序？这是SRY基因两端已知的DNA序列。

　　生：引物和模板链的3'端碱基互补配对。先将DNA分子双链打开，找到两条链的3'端，根据模板链3'端的碱基排列顺序碱基互补配对，就能得到引物b和引物e。

　　师：由此可推，设计引物碱基序列主要依据什么？

　　生：扩增基因的3'端部分核苷酸序列。

　　师：有同学问，引物设计能不能短一点？

　　生：不可以。组成引物的核苷酸数量越多，出现相同碱基排列顺序概率越低，引物特异性越强，意味着引物只能和模板链上特定DNA片段结合，才能扩增出特定DNA片段。引物太短，特异性差，会导致引物和模板随机结合，得到非特异性产物。

　　师：设计了引物，接下来怎么合成引物？

　　生：核苷酸序列已知，DNA片段又不长，这种情况可用DNA合成仪，用化学方法直接人工合成。结合图可知，一般PCR过程需加入两种引物，设计引物还需注意哪些问题？这是某同学设计的两组引物，都不太合理，大家分析下原因。

　　生：第一组引物中，只要将引物1或引物2换个方向，两个引物间就能碱基互补配对，使引物失去和模板链结合能力，无法扩增特定目的基因。第二组引物中，引物1自身折叠后，两个DNA片段间也能碱基互补配对，引物1就不能和相应模板链碱基互补配对，导致同样结果。所以设计引物时，要注意引物自身及引物间不应存在互补序列。

　　师：PCR过程中，退火温度必须根据引物碱基数量和种类设定。下表是根据模板设计的两对引物序列，判断哪一对引物需要较高退火温度？

　　生：退火是引物与模板链结合，退火温度设定一般比解链温度低5 - 10摄氏度左右，可根据解链温度判断退火温度高低。DNA分子结构越稳定，解链温度越高，所需退火温度越高。观察引物对a和引物对b，引物对b中G - C碱基对含量明显高于引物对a，且G - C碱基对间有3个氢键，所以引物对b对应的DNA结构更稳定，需较高解链温度，PCR扩增时需较高退火温度。