师：各位同学，大家好，今天我们一起来学习两种微生物的分离与计数，这部分内容属于“微生物的培养和应用”的第二课时。上一节课，我们一起学习了基本的微生物技术，简单回顾一下，主要包括培养器的配置、无菌技术以及接种技术等相关知识。本节课，我们将以尿素分解菌的分离计数以及纤维素分解菌的分离与鉴定，来学习微生物技术的应用。

　　大家看这张图片，这是正常水稻和缺氮水稻的对比图。通过比较不难发现，水稻缺氮会使叶片发黄，这说明水稻生长需要氮元素。尿素是一种重要的农业氮肥，却不能直接被植物吸收，好在土壤中存在一种能分解尿素的微生物，解决了这个难题。那么，怎样从土壤中分离出这种微生物呢？

　　再者，水稻等农作物收割后会留下大量秸秆，焚烧会污染环境，不符合生态经济理念，不烧又影响种地。实践表明，土壤中存在一种微生物，利用它产生的纤维素酶可以对秸秆进行发酵，生产燃料乙醇，实现变废为宝。这张图就是大概的流程图，主要包括预处理、酶解、发酵，最后得到乙醇。同样，怎样从土壤中分离出这种微生物呢？接下来，我们将以这两种微生物的分离和计数，详细学习微生物的应用技术。

　　我们都知道，实验的核心是实验目的，那么这两个实验的目的是什么呢？请同学们回忆所学知识。

　　生：土壤中分解尿素细菌的分离和计数，主要目的有两个，一是从土壤中分离出能够分解尿素的细菌，二是统计每克土壤样品中这类细菌的数量。分解纤维素微生物的分离和鉴定，实验目的也主要有两个，一是从土壤中分离出能够分解纤维素的微生物，二是对分离出的纤维素分解菌进行鉴定。

　　师：很好，学习了具体实验目的，接下来我们进行实验研究思路的学习。首先学习筛选与鉴定菌株的原理、方法以及现象，请同学们简单回忆，并将表格中的信息补充完整。通过分析回忆，我们可以得出，尿素分解菌筛选的原理是在选择培养基的配方中，将尿素作为唯一的氮源，这样只有能够利用尿素的微生物才能生长。同样，纤维素分解菌的筛选原理是在选择培养基的配方中，把纤维素作为唯一的碳源，原则上只有能够利用纤维素的微生物才能生长。

　　具体的鉴定原理，尿素分解菌鉴定的原理是利用分解尿素的微生物能够生成脲酶，使尿素产生氨，从而导致pH升高，加入酚酞指示剂后会出现红色。请同学们具体看一下实验现象。同样，纤维素分解菌鉴定的原理是利用其能够产生纤维素酶，纤维素酶可以将纤维素分解。当纤维素被分解后，纤维素 - 刚果红形成的红色复合物将不复存在，从而出现透明圈，这种方法称为刚果红染色法，我们具体的观测指标是是否出现透明圈。关于刚果红染色法，请同学们重点关注一下，接下来学习刚果红染色法，它主要有两种方法。

　　第一种方法是在培养基上先培养出菌落，然后在长出菌落的培养基上覆盖一层1毫克每升的刚果红溶液，10 - 15分钟后倒去刚果红溶液，再加入1摩尔每升的氯化钠溶液，15分钟后倒去氯化钠溶液，大家会发现在培养基上出现了透明圈，这个透明圈所代表的菌落就是能够分解纤维素的微生物。

　　第二种方法是将刚果红溶液配好后进行灭菌，和培养基混合均匀，然后倒平板。在平板长出菌落后，倒置培养一段时间，大家就会在平板上观察到透明圈。这两种染色方法各有优缺点。方法一最大的优点是颜色反应基本上就是纤维素分解菌的作用，缺点是操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂；方法二操作比较简单，不存在菌落混杂的问题，但产生淀粉酶的微生物也会产生模糊的透明圈，有些微生物能够降解色素，从而形成明显的透明圈。所以在具体操作过程中，我们要根据实际情况选择恰当的刚果红染色方法。

　　请同学们分析右面的三张培养基成分配方表，说出各自的物理状态、功能以及目的是什么？

　　生：培养基一和2中含有琼脂，所以物理状态上属于固体培养基，3没有琼脂等凝固剂，属于液体培养基。培养基配方一中含有尿素，且尿素是唯一的氮源，从功能上属于选择培养基，目的是筛选出能够分解尿素的细菌。培养基配方2中含有刚果红，是一种鉴别培养基，可以鉴别出纤维素分解菌的菌落。培养基配方3中含有纤维素粉，其他物质也含有碳元素，能使能够分解纤维素的细菌大量繁殖，达到富集纤维素分解菌的目的，从功能上也属于选择培养基，目的主要是增加纤维素分解菌的浓度。

　　师：非常好，那么如何对微生物进行计数呢？请同学们看下面两张图，通过图大家不难发现，这是血球计数板，右图是血球计数板在显微镜下计数室的情况。我们可以利用血球计数板在显微镜下计算一定容积中样品中微生物的数量，这种方法称为直接计数法，它有明显的优点，直观快速，操作简单。但同时也有明显的缺点。

　　生：第一个缺点是不能区分死菌或者活菌，计数时往往将死菌也一并计入，导致计算结果偏高；第二个缺点是不适用于对运动的细菌进行计数；第三个缺点是需要相对高的细菌浓度，个体小的细菌在显微镜下很难观察到。

　　师：没错，除了这种方法之外，还有稀释涂布平板法。当样品的稀释度足够高时，培养基表面会生长出菌落，一个菌落来自于样品稀释液中的一个活菌。下面这张图就是具体的计数操作流程，请同学们想一想，利用稀释涂布平板法进行计数的原则是什么？

　　生：有两个原则，第一个是菌落适合计数的原则，细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿上的培养基含有30 - 300个菌落为宜，如果是霉菌，每个培养皿上含有10 - 100个菌落比较合适。第二个是要遵循平行重复原则，即每个稀释度取3个平板的平均值，同一稀释度的三个平板，菌落数不应相差很大。

　　师：很好，关于稀释涂布平板法，它也有自己的优点和缺点。请同学们说一说它的优点。

　　生：相对于直接计数法，它能够检测出活菌和死菌，因为死菌无法形成菌落。

　　师：那缺点呢？

　　生：当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌实际数量要少。

　　师：关于稀释涂布平板法，具体操作过程中有很多细节，请同学们思考下面两个问题。第一题，甲乙两位同学用稀释涂布平板法进行计数，甲乙各得到3个平板，有人认为乙的可信度比较低，什么原因呢？

　　生：这考的是稀释涂布平板法计数的原则。乙虽然有三个平板，但菌落适合计数的原则要求三个菌落之间数量不能相差很大，而乙同学三个平板中有一个平板上的菌落数是27，与169和176相差较大，结果重复性比较差。

　　师：我们来看第二题。对分解尿素的微生物进行计数时，接种前要随机取若干灭菌后的空白平板，先培养一段时间，为什么呢？