师：同学们大家好，在上节课我们提取了生物材料当中的基因组DNA。那么，如何扩增其中的目的基因呢？这时候就要用到一项技术，叫做多聚酶链式反应，简称PCR。这是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，目前已广泛应用于遗传病诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA测序等方面。今天我们一起来复习多聚酶链式反应PCR，它实际上就是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程。同学们看一下，在细胞内进行DNA分子复制时，一些组份分别发挥着什么样的作用呢？

　　解旋酶，可以打开DNA的双链，作用于亲代DNA，而DNA的两条母链都可作为复制的模板。四种游离的脱氧核苷酸作为合成的原料，DNA聚合酶则催化DNA子链的合成。另外，还需要一小段RNA作为引物，这样DNA聚合酶才能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。那么，在细胞外又该如何设置这样的反应体系呢？在某次PCR操作时，科研人员按反应体系向试管中加入了各个试剂，并在高温下进行右图所示的循环操作。请问，这些材料分别充当了DNA复制过程中的哪些条件？

　　下面我们依次展开。对于DNA复制而言，解旋是第一步，在细胞中是如何实现的呢？在试管中又是如何实现的？借助刚刚的复习可知，解旋时在细胞中借助解旋酶作用于氢键，边解旋边复制；而在试管中，我们通过加热断开氢键，完全打开两条链。

　　DNA分子具有热稳定性，在一定温度下，DNA的双螺旋结构会打开形成两条单链；若温度逐步降低，两条单链又可重新合成双链。在具体操作过程中，解旋酶只能作用于很短的一段DNA双链，所以我们无法准确判断解旋酶在哪个时间段打开了哪一段DNA分子。

　　那么，催化DNA子链合成的酶是哪种呢？这个酶叫做DNA聚合酶。在细胞中进行DNA复制时，除利用DNA聚合酶外，还需要DNA连接酶。原因是两条子链，一条连续合成，另一条不连续合成，不连续合成的这条子链就需用到DNA连接酶。而在PCR反应过程中，通过加热完全打开两条链，因此不需要使用DNA连接酶。由于第一步是通过加热使两条链打开，所以这样的聚合酶必须耐高温，我们称之为Taq酶。过高的温度和过长的时间都会影响Taq酶的活性。

　　DNA聚合酶还有个特点，它只能从3'端开始连接脱氧核苷酸，不能从头开始合成。那么，PCR还需要提供什么条件呢？同学们看这张图，脱氧核糖作为五碳糖，其5号位连有磷酸基团，所以游离的磷酸位于脱氧核苷酸链的5'端；另外，脱氧核糖3'位置的碳连有羟基，游离的羟基就位于脱氧核苷酸链的3'端。

　　在合成时，单个核苷酸只能连接到已有的核酸片段上，因此需要给它提供一段引物，引物实际上就是提供游离的羟基，然后在DNA聚合酶作用下不断延伸形成磷酸二酯键。引物关系到整个PCR反应是否成功，接下来我们看看引物设计有哪些条件要求。这是新型冠状病毒核酸检测，采用逆转录PCR技术，将待测样本处理后，先将RNA逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行扩增。如图是两种引物序列，请同学们思考以下问题。

　　设计引物的碱基序列主要依据是什么？刚刚提到，引物是为了子链的延伸，所以引物的碱基顺序应和模板链碱基互补配对。另外，子链的延伸是从5'端向3'端进行，对应到模板链上就是3'端的核苷酸序列。因此，引物的碱基序列应和扩增基因模板链3'端核苷酸序列互补配对。

　　借助这个序列去设计引物的碱基序列，像表格中的引物1和引物2分别对应右图的哪一位置呢？我们可以先画出子链的延伸方向，比如这样画出子链延伸方向，子链和模板链碱基互补配对，借助模板链就能写出子链上相应的碱基顺序。

　　在模板链的3'端有GAA三种碱基，那么在新合成的子链上对应的就是TTC。这样一段碱基可与引物1对应起来看，因此引物1位于位置1。借助同样的分析，同学们也能判断一下引物2位于哪里，引物2应该位于位置2。下面关于引物，请同学们继续思考这些问题。引物的化学本质是什么呢？在细胞中进行DNA复制时，需要的引物是RNA片段；但在PCR反应体系中，我们使用一小段单链DNA或者RNA。若使用RNA作为引物，在PCR反应合成结束后，还要将这一段引物去除掉。PCR反应体系第一步之后就是复性，在复性中，引物会与模板链配对结合，因此复性所需的温度与时间取决于引物的长度、碱基组成以及浓度等因素。那么，我们设计的引物为什么不能太长，又为什么不能太短呢？

　　如果引物太短，引物的特异性就比较差，引物会随机结合得到许多非特异性的产物；而引物如果太长，合成难度就会加大，且引物越长越容易发生自连。同时，过长的引物还会导致其延伸温度大于74度，对于Taq酶而言，它的适宜温度在70 - 75度，如果延伸温度大于74度，就不适于Taq酶进行反应了。在下图中是两种引物的TM测定结果，请你借助图判断哪种引物GC含量比较高。

　　对于GC碱基对，它会形成三根氢键，而AT碱基对会形成两根氢键，相对而言，GC含量高的所需温度也就会高。借助这张图，我们可推断出引物2的GC含量较高。某同学设计了两组引物，这两组引物都不合理，你们能不能看看这两组引物哪里不合理了？请说明理由。

　　同学们，我们一起来看第一组引物。仔细观察，如果将引物2颠倒一下位置，会发现引物2的碱基刚好可以和引物1发生碱基互补配对。再来看第二组引物呢？先看引物1，观察一下，如果将引物1从中间对折过来，发现它们刚好也可以碱基互补配对，形成一个发卡结构。所以这两组引物会发生局部的碱基互补配对，或者自身折叠后碱基互补配对，因此都不合理。同学们在进行引物设计时就要注意避开这些问题。为了方便构建重组质粒，我们在引物上还要添加酶切位点。那么在引物的哪一端添加酶切位点呢？由于DNA合成时，新链的延伸方向是从5'端向3'端进行，也就是说脱氧核苷酸是连接到3'端上的，因此我们只能在5'端加上酶切位点。整个退火温度的设定关系着整个实验的成败，退火温度如果过高，同学们考虑过可能造成什么影响吗？

　　如果温度过高，就会破坏引物和模板的碱基互补配对，从而降低PCR的效率，所以这些温度的设定都要慎之又慎。图中的引物是单链DNA片段，从理论上来推测一下，第四轮循环产物当中含有引物a的DNA片段所占比例是多少？对于这样的题目，最好的解决办法就是画图。看，这是最初的一个DNA分子的两条模板链，接下来它进行第一轮循环。两条链分别作为模板链，我用不同颜色表示两种不同的引物，这时复性，接下来进行延伸，就形成了两个DNA分子，这两个DNA分子需要用到引物a和引物b各一个。然后接下来进行第二轮循环，第二轮循环就是以这两个DNA分子的四条链都作为模板，经过引物跟模板链的结合，再进行子链的延伸。要注意，引物是不可以反复使用的，引物会成为子链的一部分。这样经过第二轮循环后，就形成了4个DNA分子，同学们也可以观察一下，其中引物a大概需要3个，引物b从现有的图中也可看到需要3个。那么如果进行第三轮循环又是怎样的情况呢？这个时候要把这8条链都作为模板链，首先变性，然后复性，接下来延伸，经过第三轮循环，最终形成8个DNA分子，同时我们也第一次观察到和目的基因等长的片段。在这8个DNA分子当中，含有引物a、引物b各有7个。那么如果按照题目所说，还要进行第四轮循环的话，最终形成DNA分子数是16个，借助前面的分析，你可以寻找一下规律。